本发明公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。这对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)由一对DNA识别蛋白分别与Fok1 DNA内切酶的两个异源亚基融合得到,可以特异性地识别山羊或绵羊朊蛋白基因(PRNP)exon2上的两个相邻位点。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时,其能对宿主细胞PRNP基因的exon2位点打靶,并使打靶位点发生基因突变,从而实现对山羊或绵羊PRNP基因的靶向修饰,具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
1.一对短肽,其特征在于,所述一对短肽分别具有如SEQxa0IDxa0NO.1和SEQxa0IDxa0NO.2所示的氨基酸序列。
2.一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别编码如权利要求1所述的一对短肽。
3.如权利要求2所述一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.3和SEQxa0IDxa0NO.4所示的碱基序列。
4.一对蛋白质,其特征在于,所述一对蛋白质由权利要求1所述的一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成;其中,所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的或经过人工改造的序列。
5.如权利要求4所述一对蛋白质,其特征在于,所述一对蛋白质分别具有如SEQxa0IDxa0NO.5和SEQxa0IDxa0NO.6所示的氨基酸序列。
6.一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别编码如权利要求4或5所述的一对蛋白质。
7.如权利要求6所述一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.7和SEQxa0IDxa0NO.8所示的碱基序列。
8.一对融合蛋白,其特征在于,所述一对融合蛋白由权利要求4所述的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。
9.如权利要求8所述一对融合蛋白,其特征在于,所述的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白的二个亚基融合。
10.如权利要求9所述一对融合蛋白,其特征在于,所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok1DNA内切酶。
11.如权利要求8-10任一权利要求所述一对融合蛋白,其特征在于,所述一对融合蛋白分别具有如SEQxa0IDxa0NO.9和SEQxa0IDxa0NO.10所示的氨基酸序列。
12.一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别编码如权利要求8-10任一权利要求所述的一对融合蛋白。
13.一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别编码如权利要求11所述的一对融合蛋白。
14.如权利要求13所述的一对多核苷酸,其特征在于,所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.11和SEQxa0IDxa0NO.12所示的碱基序列。
15.一种包含权利要求2-3、6-7、13或14任一权利要求所述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的载体。
16.一种用权利要求15所述载体转化的宿主细胞。
17.一种包含权利要求12所述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的载体。
18.一种用权利要求17所述载体转化的宿主细胞。
19.如权利要求16或18所述宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为山羊或绵羊IPS细胞。
20.一种如权利要求11所述一对融合蛋白或如权利要求14所述一对多核苷酸在对山羊或绵羊朊蛋白基因靶向修饰中的应用。
21.一种山羊或绵羊朊蛋白基因打靶的方法,其特征在于,包括:将权利要求11所述一对融合蛋白或者权利要求13或14所述一对多核苷酸或者含有权利要求13或14所述一对多核苷酸的载体转入山羊或绵羊IPS细胞,于30-37°C扩增培养3-7天,得到朊蛋白基因被靶向修饰的细胞。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述山羊或绵羊IPS细胞中还转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒。
23.如权利要求21或22所述的方法,其特征在于,所述扩增培养过程中至少有1天在30°C下进行。技术领域
本发明涉及基因工程领域,尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。
背景技术
按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列,一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究,另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。朊蛋白类疾病,也叫传染性海绵状脑病,是一类致命的传染性中枢神经系统退行性疾病,主要包括:发生在绵羊和山羊的羊搔痒病,发生在牛的牛海绵状脑病(即疯牛病),以及发生在人的克雅氏病(CJD)、G综合症、致死性家族失眠症(FFI)等。动物基因组编码的朊蛋白(prpC,一种锚定在神经细胞、淋巴细胞和别的细胞外表面的膜糖蛋白)是一种与传染性海绵状脑病的发生直接相关的分子。虽然已有实验证明缺失prpC的小鼠不仅能够正常发育和繁殖后代并且具有抵抗传染性海绵状脑病的能力,然而缺失prpC的大型动物,尤其是那些在自然条件下可以自发感染该类疾病的大型动物,目前的研究距离实用性差距仍然很远。2001年英国的科学家使用绵羊胎儿成纤维细胞基因打靶再通过体细胞克隆获得了四只Prnp+/-的羊羔,但其中三只都在出生后死亡,存活最久的也仅仅在世12天。2004年Kuroiwa等使用胎牛成纤维细胞敲除了牛编码PrP的基因。2006年,Goldingxa0MC等利用RNAi干涉技术针对引起牛疯牛病和羊搔痒病的PRNP基因序列设计有效的siRNA,获得一头转基因羊胎儿,对其检测发现siRNA很好地抑制了体内PRNP基因的表达。我国科学家也致力于羊瘙痒症的研究,成国祥等获得了5只成活的Prnp+/-山羊。此后,他们将Prnp+/-的成年山羊体细胞进行二次基因打靶,将获得的Prnp-/-体细胞进行克隆,但仅仅获得了孕73天的Prnp-/-山羊胎儿,未得到成活的转基因羊。从中我们可以推测Prnp+/-山羊的繁育情况并不容乐观,二次基因打靶加再次的体细胞克隆的难度远远大于Prnp+/-山羊的自然交配获得纯合体。目前为止,虽然国内外的科学家们付出了艰苦的努力,但仍未获得Prnp-/-的成年羊。此外,绵羊和山羊虽然都可能得羊瘙痒症,但该病是主要发生于绵羊中的,而绵羊与山羊是同科而不同属的动物,绵羊和山羊之间不能交配产羔,因此获得PRNP基因敲除的绵羊是具有重要的科学和经济价值的。但人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换,其打靶效率非常低,通常只有10^-6-10^-8,这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用,而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域,然后非特异性核酸内切酶切断双链DNA从而造成DNA双链断裂(double-strandxa0break,DSB),引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶(Zinc-fingerxa0nucleases,ZFN)是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列,并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fok1的两个单聚体定位到了一起,DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA,从而造成DSB。ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步,然而,ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题,研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵(20万人民币/基因),一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子(transcriptionxa0activator-likexa0effector,TALE)表现出DNA结合特异性,而其识别密码具有模块化和简单化的特点,为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。TALE与Fok1融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶(transcriptionxa0activator-likexa0effectorxa0nucleases,TALEN)。TALEN的打靶原理与ZFN相同,只是识别特异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸,第12和13位残基是靶向识别的关键位点,被称作重复可变的di-residues(RVDs)位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基,TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。Sangamoxa0BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究,两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》(Naturexa0Biotechnology)杂志上。Edwardxa0Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5基因时,证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发了一种基于分层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模块的DNA序列,同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR获得了带有特异性连接序列的单体,并将其克隆至包含TALExa0N-末端和C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子,研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中,研究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。今年7月MIT的Rudolfxa0Jaenisch小组也验证了TALEN在人胚胎干细胞和人iPSC中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作对比,得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamoxa0BioSciences公司购买的ZFNs相似,进一步验证了TALENs是非常好的基因组编辑工具。
发明内容
本发明提供了一对短肽,利用这对短肽构建获得的一对转录激活子样效应因子(TALE)能够特异性地识别山羊或绵羊朊蛋白基因(PRNP)基因组上的二段相邻核苷酸;利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN),能够对山羊或绵羊朊蛋白基因进行准确、高效地打靶。一对短肽,所述一对短肽分别具有如SEQxa0IDxa0NO.1和SEQxa0IDxa0NO.2所示的氨基酸序列。本发明提供了一对多核苷酸,所述一对多核苷酸分别编码上述的一对短肽。优选地,所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.3和SEQxa0IDxa0NO.4所示的碱基序列。其中,所述的多核苷酸由分别识别山羊或绵羊朊蛋白基因上核苷酸序列SEQxa0IDxa0NO:17和SEQxa0IDxa0NO:20中相应碱基的TALENs识别模块依序连接而成,其中,识别碱基A的TALENs识别模块为NI-A(如SEQxa0IDxa0NO:22所示),识别碱基T的TALENs识别模块为NG-T(如SEQxa0IDxa0NO:23所示),识别碱基C的TALENs识别模块为HD-C(如SEQxa0IDxa0NO:24所示),识别碱基G的TALENs识别模块为NK-G(如SEQxa0IDxa0NO:25所示)。本发明还提供了一对蛋白质,所述一对蛋白质由上述的一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成;其中,所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的或经过人工改造的序列。这对蛋白质可以分别特异性地识别山羊或绵羊朊蛋白基因(PRNP)上的二段核苷酸序列,所述二段核苷酸序列分别选自以下二个核苷酸序列:(1)SEQxa0IDxa0NO:17序列或SEQxa0IDxa0NO:17序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列;(2)SEQxa0IDxa0NO:20序列或SEQxa0IDxa0NO:20序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列。优选地,所述的这对蛋白质分别具有如SEQxa0IDxa0NO.5和SEQxa0IDxa0NO.6所示的氨基酸序列。该蛋白质为转录激活子样效应因子,命名为PRNP-TALE-L614和PRNP-TALE-R629。本发明还提供了一对多核苷酸,所述一对多核苷酸分别编码上述的一对蛋白质。优选地,所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.7和SEQxa0IDxa0NO.8所示的碱基序列。本发明还提供了一对融合蛋白,所述一对融合蛋白由上述的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。优选地,所述的DNA切割蛋白为DNA内切酶。优选地,所述的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白的二个亚基融合。更优选地,所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok1DNA内切酶。最优选地,所述一对融合蛋白分别具有如SEQxa0IDxa0NO.9和SEQxa0IDxa0NO.10所示的氨基酸序列。该融合蛋白为转录激活子样效应因子核酸酶,命名为PRNP-TALEN-L614和PRNP-TALEN-R629。本发明还提供了一对多核苷酸,所述一对多核苷酸分别编码上述的一对融合蛋白质。优选地,所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.11和SEQxa0IDxa0NO.12所示的碱基序列。本发明还提供了一种包含上述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的载体。优选地,可以先将能特异性识别SEQxa0IDxa0NO.17或SEQxa0IDxa0NO.20所示碱基序列的多核苷酸连接到中间载体pCMV-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-intermediate上,再将该中间载体连接到最终载体pEFxa01a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-pA或最终载体pEFxa01a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA上,构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基因的质粒载体,能表达转录激活子样效应因子核酸酶。本发明还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。优选地,所述宿主细胞为山羊或绵羊细胞;更优选地,所述宿主细胞为山羊或绵羊IPS细胞。本发明还提供了一种上述一对融合蛋白或上述一对多核苷酸在对山羊或绵羊朊蛋白基因靶向修饰中的应用。优选地,所述一对融合蛋白分别具有如SEQxa0IDxa0NO.9和SEQxa0IDxa0NO.10所示的氨基酸序列;所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.11和SEQxa0IDxa0NO.12所示的碱基序列。本发明还提供了一种山羊或绵羊朊蛋白基因打靶的方法,包括:将上述一对融合蛋白或者上述一对多核苷酸或者含有这对多核苷酸的载体转入山羊或绵羊IPS细胞,于30-37°C扩增培养3-7天,得到朊蛋白基因被靶向修饰的细胞。优选地,所述一对融合蛋白分别具有如SEQxa0IDxa0NO.9和SEQxa0IDxa0NO.10所示的氨基酸序列;所述一对多核苷酸分别具有如SEQxa0IDxa0NO.11和SEQxa0IDxa0NO.12所示的碱基序列。优选地,所述山羊或绵羊IPS细胞中还转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒,便于筛选。优选地,所述扩增培养过程中至少有1天在30°C下进行,能获得更好的打靶效果。本发明针对山羊或绵羊PRNP基因的一个位点设计了一对转录激活子样效应因子核酸酶(PRNP-TALEN-L614和PRNP-TALEN-R629),这对TALENs分别由可以识别PRNP基因上一段核苷酸的DNA识别结构域与一个Fok1xa0DNA内切酶的两个异源亚基融合得到。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时,其能对宿主细胞PRNP基因的位点打靶,并使打靶位点发生基因突变,包括碱基缺失、碱基插入等,从而实现对山羊或绵羊PRNP基因的靶向修饰,具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
附图说明
图1为人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶识别的DNA序列及位点;图2为18个识别模块连接策略示意图;其中,A:PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头过程示意图;B:PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头后示意图;C:PCR扩增6模块片段与中间载体示意图;D:最终构建的TALEN质粒示意图;图3为中间载体pCMV-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-intermediate示意图;图4为最终载体pEFxa01a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-pA示意图;图5为最终载体pEFxa01a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA示意图;图6为PRNP基因在打靶位点的基因型变化;其中,-表示碱基缺失。
具体实施方式
以下实施例中所使用的技术,包括PCR扩增与检测、细胞转染等分子生物学技术,以及细胞培养、检测技术等,除非特别说明,均为本领域内的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂和细胞系等,除非是本说明书特别注明,均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。实施例1xa0TALENs靶序列的设计1、从NCBI上下载山羊和绵羊PRNP基因组序列(绵羊Genexa0ID:493887,山羊PRNP基因序列与绵羊的相同)2、设计引物并PCR扩增基因组上打靶位点片段,并测序,其中,PCR引物及测序引物见表1;表1 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 3、设计TALENs识别序列(靶序列):根据测序得到的序列,并依照以下原则确定TALENs识别序列:(1)第0位碱基为T(识别序列第一位之前的碱基为第0位)(2)最后一位碱基为T(3)识别序列长度在13-19之间(4)二个识别序列之间的间隔序列(Spacer)长度控制在13-21之间(12也可,但效率可能较低)设计得到的靶序列位置如图1所示,具体序列见表2。表2 xa0xa0TALE名称
xa0xa0靶序列
xa0xa0PRNP-TALE-L613(SEQxa0IDxa0NO:16)
xa0xa0GACTATGAGGACCGT
xa0xa0PRNP-TALE-L614(SEQxa0IDxa0NO:17)
xa0xa0GACTATGAGGACCGTT
xa0xa0PRNP-TALE-L617(SEQxa0IDxa0NO:18)
xa0xa0ATGAGGACCGTTACT
xa0xa0PRNP-TALE-R627(SEQxa0IDxa0NO:19)
xa0GGGGTAACGGTACATGT
xa0xa0PRNP-TALE-R629(SEQxa0IDxa0NO:20)
xa0xa0TGGGGTAACGGTACAT
xa0xa0PRNP-TALE-R633(SEQxa0IDxa0NO:21)
xa0xa0TGGTTGGGGTAACGGT
实施例2xa0TALENs识别模块之间的连接及重组载体的构建1、TALENs识别模块(modular)的获得(1)合成分别识别碱基A、T、C、G的四个识别模块NI、NG、HD、NK,序列见表3。表3 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> (2)将四个片段连入pEASY-B载体(购自北京全式金公司),连接方法为:1取PCR产物3μl;2加入1μlxa0pEASY-B载体;325°C,7min;4转化DH5a感受态细胞,涂布卡纳霉素平板;5挑取克隆、小量提取质粒、酶切、测序,最后得到连接到载体pEASY-B中的识别模块NI、NG、HD、NK。2、识别模块之间的连接连接策略:以19个识别模块的连接为例,说明连接策略。因最后一个可以识别碱基T的半个模块已在载体上,所以只要连18个模块即可,连接示意图见图2。(1)将识别序列(靶序列)分为三个部分(分别为原序列SEQxa0IDxa0NO:16-21去掉最后一个碱基,如下所示),即每条识别序列先分为三段,每段含有3-6个碱基,相应地每段对应3-6个识别模块,先以每段为单位,将该段的3-6个识别模块连接。 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> (2)3-6个识别模块之间的连接方法1PCR扩增添加酶切识别序列和连接接头以6个识别模块之间的连接为例:图2(A)为6个模块PCR添加酶切识别序列和连接接头过程示意图,其中引物F1、F7、F8、R6、R7、R8带有Bbs1酶切识别序列,引物F2、F3、F4、F5、R1、R2、R3、R4、R5带有Bsa1酶切识别序列。Bbs1识别序列(SEQxa0IDxa0NO:26)为GAAGACNN‘NNNN,Bsa1的识别序列(SEQxa0IDxa0NO:27)为GGTCTCN‘NNNN,这两个酶都属于typexa0IIsxa0enzymes,同一个酶切识别序列可以产生多个粘性识别末端,理论上可以产生4⁴个粘性识别末端,再加上每个模块的结尾和开头Gly密码子4种,Leu密码子6种的限制,利用一个typexa0IIsxa0enzyme可以产生24种接头。我们选取其中的16种设计了引物,除了F1与R8外,F_n可与R_n+1的粘性末端相连,而不能与其他引物上的粘性末端相连。同样地,如果是5模块,4模块,3模块连接,则分别在第4,第3,第2个连接模块添加F4R6,F3R6,F2R6引物即可,相应的前面的模块和最后一个模块加的引物保持不变,连接的片段数则相应的减少1、2、3个模块片段。各个引物序列(SEQxa0IDxa0NO:28-43)见表4。表4 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 注:小写加粗字母为酶切位点的识别序列PCR扩增体系(50μl)为:DNA模板(Template):0.5μl(约50ng)引物(Primer):每个1μl(50μM)LATaq酶(Takara):0.3μl10×缓冲液(buffer):5μldNTP:2.5μl(2.5μM)ddH₂O:40.7μlPCR程序:95°C2min;95°C15s,55.8°C30s,72°C11s,36个循环;72°C延长10min。PCR后即可得到如图2(B)中的片段,每个模块按照目的结合序列被加上不同的内切酶识别序列和不同的接头,相同颜色的两个接头表示两者产生的粘性末端可以相连。2纯化将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,确定浓度。使用天根公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)纯化PCR片段,纯化后在进行琼脂糖凝胶电泳标定各个产物的浓度。3酶切连接因相邻的模块连接后不再能被Bsa1切开所以本连接可以酶切连接同时进行,酶切连接体系为:模块:100ng/模块(3-6)Bsa1(NEB):1μlT4连接酶(fermentas):1μlT4连接酶缓冲液(NEB):2μlddH₂O:补至20μlPCR酶切连接程序:37°C5min,20°C5min,35-45个循环;80°C10min。(3)将三段3-6模块的片段连接到中间载体pCMV-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-intermediate上1扩增3-6模块片段将上一步骤酶切连接的20μl产物全部进行琼脂糖凝胶电泳,会出现一个模块长度倍数大小的一个数条有梯度的条带,切胶回收最上面的条带。把切回的小块凝胶小心地放在带滤膜的200μl移液枪的枪头中,把枪头放在1.5ml离心管(EP管)中;以最大转速离心5min,离心后用200μl的移液枪将枪头中没有全部甩到离心管中的液体全部吹到离心管中;离心下来的液体既可作为PCR扩增多模块片段的模板之用。PCR扩增的引物为F-assem和R-assem,序列见表5。表5 xa0xa0引物名称
xa0引物序列
xa0xa0F-assem(SEQxa0IDxa0NO:44)
xa0CGGGAGCCGACGTCGACAG
xa0xa0R-assem(SEQxa0IDxa0NO:45)
xa0CGCTCGAGCGACACGCAGG
PCR体系(50μl):模板:2μl引物:eachxa00.5μl(50μM)Accuprimexa0pfx:0.3μl10×缓冲液:5μlddH₂O:42.2μlPCR程序:95°C2min;95°C15s,64°C30s,68°C50s,35个循环;68°C延长10min。2纯化PCR产物将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,确认有无杂带以及目的条带的浓度。如果无杂带或杂带相对于目的条带比例很低则用直接Kit纯化PCR产物;如果杂带较多则需要胶回收纯化。纯化后电泳标定条带浓度。3酶切中间载体pCMV-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-intermediate因最终载体上有bbs1酶切位点,而与3个3-6模块片段连接时,连接与bbs1的酶切是同时进行的。所以不能直接连到最终载体上,而只能先连到没有bbs1酶切位点的中间载体上。中间载体的示意图见图3。中间载体酶切体系:质粒:5μgBsmB1:2μlDTT(100mM):1μlddH₂O:补足100μl37°C酶切过夜,酶切中每过两个小时补0.5μlxa0BsmB1,并混匀,最好换一个管子,以消除钉在管壁上未被酶切的环形质粒。酶切好后电泳确定质粒是否已全部线性化。确定好后,Kit纯化酶切产物,电泳标定载体浓度。4三片段与中间载体的连接与Bsa1相同,Bbs1也是typexa0IIsxa0enzyme,酶切产生的粘性末端连接后是不能被该酶切开的,所以这个连接也可以酶切连接同时进行的。载体:100ng模块:200ng/模块Bbs1(fermentas):1μlT4连接酶(fermentas):1μlT4连接酶缓冲液(NEB):2μlddH₂O:补至20μl酶切连接程序:PCR程序:37°C5min,20°C5min,35-45个循环;80°C10min。5转染,挑选克隆,小量提取质粒,酶切鉴定,测序鉴定连接完后取10μl转化DH5a感受态,剩下的10μl于-20°C冻存。第二天挑一定数量的单克隆(大于10个/板),第三天小量提取质粒,得到的质粒用BamH1和Pst1酶切鉴定,连接正确的应该有2kb左右的条带,而自连的得会有约550bp条带。酶切正确后送测序,测序正确即可得到14-19个片段连接成功克隆了。测序引物见表6,其中,连接成功的PRNP-TALE-L614,PRNP-TALE-R629的氨基酸序列分别如SEQxa0IDxa0NO:5,SEQxa0IDxa0NO:6所示;PRNP-TALE-L614中的16.5个模块的氨基酸序列如SEQxa0IDxa0NO:1所示,PRNP-TALE-R629中的16.5个模块的氨基酸序列如SEQxa0IDxa0NO:2所示。表6 xa0xa0引物名称
xa0引物序列
xa0xa0TALE-正向测序(SEQxa0IDxa0NO:46)
xa0CTCCCCTTCAGCTGGACAC
xa0xa0TALE-反向测序(SEQxa0IDxa0NO:47)
xa0AGCTGGGCCACGATTGAC
(4)将连接入中间载体并测序正确的片段连入最终载体pEF1a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-pA与pEF1a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA最终载体pEF1a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(R)-pA与pEF1a-NLS-TALExa0backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA是在ZFN载体(购于Sigma公司)的基础上,用BamHI+KpnI酶切后加上TALEN的N末端和C末端后得到的。TALEN的N末端和C末端的核苷酸序列如SEQxa0IDxa0NO:48所示;最终载体的示意图见图4与图5。将连有正确片段的中间载体与两个最终载体同时用BamH1和Pst1双酶切,切胶回收相应的片段。按照设计时的左右顺序将含有Modulars的TALE连入最终载体的左右两个载体上。连接、转染、挑取克隆、小量抽取质粒,BamH1和Pst1双酶切鉴定,测序鉴定。鉴定正确的克隆即为最终我们需要的TALENs质粒。实施例3质粒的转染1、在6孔板每个孔中加入100μl基质胶,来回晃动,使之铺满整个孔的底部,铺好后置于5%CO₂培养箱中30min。2、将培养IPS细胞T25瓶中的培养基吸出,PBS吸一遍,加入1mL0.25%胰酶,来回晃动,使其均匀覆盖瓶底,置于5%CO₂培养箱中5min。3、消化完成后加入1mlxa010%DMEM中和胰酶,将消化下来的细胞转移至15ml离心管中,细胞计数,离心,1200rpm,5min。4、用适量的4*Doxxa0ES0重悬细胞,取200万IPS细胞置于已铺好基质胶的6孔板中,加入2ml新鲜的4*Doxxa0ES0。5、传代同时进行转染。6、将构建好的PRNP-TALEN-L613,PRNP-TALEN-L614,PRNP-TALEN-L617,PRNP-TALEN-R627,PRNP-TALEN-R629,PRNP-TALEN-R633按表7两两配对组合转染细胞,共9种组合。表7
xa0xa0PRNP-TALEN-R627
xa0xa0PRNP-TALEN-R629
xa0xa0PRNP-TALEN-R633
xa0xa0PRNP-TALEN-L613
xa0xa0L613+R627
xa0xa0L613+R629
xa0xa0L613+R633
xa0xa0PRNP-TALEN-L614
xa0xa0L614+R627
xa0xa0L614+R629
xa0xa0L614+R633
xa0xa0PRNP-TALEN-L617
xa0xa0L617+R627
xa0xa0L617+R629
xa0xa0L617+R633
根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液: ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="688"/> 体系中各成分的比例:TALEN-L∶TALEN-R∶Lv-EF1a-Mcherry=5∶5∶2总DNA∶optixa0MEM=2μg∶100μl总DNA∶Fμgene=2μg∶5μl7、转染后第二天,即可在荧光显微镜下观察Mcherry荧光亮度以及转染效率。若转染成功,则将6孔中的培养基吸掉,加入2.5μg/mlxa0puro的2ml新鲜的10%DMEM。8、置于5%CO₂培养箱中37°C培养两天,每天换2.5μg/mlxa0puro的2ml新鲜的10%DMEM培养液。9、撤掉药杀,移至30°C的5%CO₂培养箱中培养两天,培养液换为2mlxa010%DMEM。10、移至37°C的5%CO₂培养箱中培养至细胞量够抽基因鉴定之用。实施例4细胞打靶鉴定1、将药杀后的6孔板中用加入300μlxa00.25%胰酶,来回晃匀。37°C放置5min,用枪吹打使所有细胞都被消化下来。2、将300μl液体吸入1.5mlxa0EP管中,用400μl的PBS洗6孔板两次,也加入EP管中。3、13200rpm/min离心5min,弃去上清液。4、用直接PCRxa0Kit(thermo货号:F-140)抽提基因组,并PCR扩增打靶区域DNA片段。5、鉴定打靶细胞的基因型及打靶效率将上述的PRNP-TALEN-L614/PRNP-TALEN-R629组合处理的IPS细胞的基因组的PCR片段加A后连入PMD18-T载体中,单克隆化DNA片段,送测序后得到PRNP基因的打靶位点的基因型。共送31个样品测序有5个克隆发生了突变,见图6。加A体系为:DNA:10μlrTaq:0.5μl10xbuffer:1.5dNTP:0.5μlddH2O:2.5μl然后混匀,置于72°C20min。结果显示:5个突变的克隆中,全部为碱基缺失,缺失的碱基数从2个到402bp不等。在假设细胞中没有双敲除的前提下,PRNP-TALEN-L614/PRNP-TALEN-R629组合使PRNP基因发生了突变的概率是(5×2)/31,即32.3%。本研究只在PRNP基因的一个位点设计了TALENs分子就得到可以定点修饰该基因的一对TALENs,并且效率非常高。可见TALENs技术的相较于ZFN技术的优越性。该对多核苷酸可以识别SEQxa0IDxa0NO:17和SEQxa0IDxa0NO:20的核苷酸序列,而且可以识别这二个序列的一个或二个核苷酸被取代后所衍生的核苷酸序列。该对多核苷酸或其表达的融合蛋白是可以对山羊和绵羊基因高效打靶的TALENs,它们为通过同源重组制造Prnp-/-山羊或绵羊提供了一个非常高效的工具。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="365"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="345"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="347"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="345"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="394"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="397"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="398"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="346"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="346"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="356"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="347"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="346"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="369"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="399"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="399"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="397"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="345"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="346"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="345"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="343"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="347"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="347"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="346"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="398"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="399"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="398"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="399"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="435"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="448"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="432"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="474"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="454"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="426"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="402"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="408"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="452"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="447"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>